KCNN4 基因在胰腺癌中的表达及预后相关性的生物信息学分析

摘要 目的：探讨 KCNN4 基因在胰腺癌（PC）患者组织中的表达与临床特征及预后的相关性。方法：NCBI 的GEO 数据库下载相关芯片数据（GSE15471），包含 39 例 PC 组织及 39 例正常胰腺组织的基因表达谱数据，检测KCNN4 的表达情况；TCGA 公共数据库中下载PC 的RNA 测序数据及相关临床数据，对样本中的 KCNN4 基因表达数据及其对应的临床信息进行回顾性分析；采用 CEPIA 数据库分析KCNN4 基因与PC 患者预后指标（无病生存期与总生存期）的关系；采用基因集富集分析方法探讨 KCNN4 基因在 PC 中可能的作用机制。结果：芯片数据（GSE15471）证实胰腺癌组织中 KCNN4 表达水平明显高于正常胰腺组织（P<0. 05）；162 例胰腺癌患者中，KCNN4 基因表达水平与肿瘤恶性程度分级相关（P<0. 05）；生存分析示：高表达组 PC 患者无病生存期明显差于低表达组（log ‐ rank P=0. 035），KCNN4 高表达组 PC 患者总生存期明显差于低表达组（log ‐ rank P=6. 9×10-5）；GSEA 分析：KCNN4 基因高表达样本主要富集了氨基酰基tRNA 生物合成、基础转录因子及嘧啶代谢。结论：推测KCNN4 基因高表达与胰腺癌患者的进展相关，可作为潜在的预后生物标志物。
关键词：胰腺癌；KCNN4；基因表达；预后
胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是全球第四大癌症相关死亡原因，5 年生存率<8%，其高恶性生物学行为被称为“癌中之王”［1，2］。PC 是一种高度侵袭性和转移性肿瘤，手术切除是根治胰腺癌的唯一选择，但 80%~90% 的患者术后复发，预后差［3，4］。目前对胰腺癌的发病机制仍未完全阐明，但其发病过程是一个涉及多因素、多基因间的复杂的恶性生物学过程［5］。目前血清肿瘤标志物 CA19‐9 是临床上诊断 PC 的常用血清学指标，但其特异性及敏感性尚不能满足临床诊治要求［6］。目前全基因组和外显子测序已证实胰腺癌基因组具有显著和复杂的变异，因此从基因水平研究 PC 病理机制对明确PC 发病、提高早期诊断率、寻找治疗靶点、改善预后至关重要［3］。KCNN4 是中电导性钙离子依赖性钾通道家族成员，钾通道在调节膜电位、激素分泌、上皮功能、细胞增殖和凋亡方面尤为重要［7，8］。目前研究报道，KCNN4 能促进肺癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤的增殖和侵袭，其过表达与预后不良密切相关［9‐11］。然而目前对 KCNN4 在胰腺癌中的研究鲜有报道，因此本研究拟采用生物信息学的方法，探讨KCNN4 与PC 患者的相关性。
一、材料与方法
1、数据资料收集 Gene Expression Omnibus（GEO）数据库是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）建立的基因表达资源库，从 GEO 公共数据库（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/gds）中下载PC 基因表达谱（研究号为 GSE15471），芯片平台为 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2. 0 Array（GPL570）。GSE15471 数据集包含 39 例 PC 组织及 39 例正常胰腺组织的基因表达谱数据（样本来源：罗马尼亚），检测 KCNN4 在PC 与胰腺正常组织的表达情况。人类癌症基因组图谱数据库（TheCancer Genome Atlas，TCGA）自 2006 已经在美国启动，目前包括了 33 种恶性肿瘤，在 TCGA 公共数据库（https：//cancergenome. nih. gov/）中下载 PC样本的 RNA 测序数据（均使用 Illumina Hiseq 测序技术）及相关临床数据（样本来源：美国）。183 例PC 样本 RNA 测序数据，提取 162 例临床信息完整的病例。
2 、数据筛选及分组下载经校对后的 162 例PC 样本 RNA 测序数据。根据矩阵中 KCNN4 表达值的中位数，将 PC 临床样本分为KCNN4 低表达组（n=81）和 KCNN4 高表达组（n=81），分析两组中KCNN4 基因的表达水平与 PC 患者的临床特征相关性。纳入研究的PC 病例，平均年龄 64. 6 岁，男性89 例（54. 9%），106 例（65. 4%）饮酒，起病部位分别为 128 例（79. 0%）胰头、23 例（14. 3%）胰体或胰尾、11 例（6. 7%）胰颈，117 例（72. 2%）淋巴结转移，肿瘤恶性程度分级G1、G2、G3 分别为 28 例（17. 3%）、86 例（53. 1%）、48 例（29. 6%），TNM 分期Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ+ Ⅳ期分别有 20 例（12. 3%）、135 例（83. 3%）、7例（4. 4%）。
3、数据集分析 KCNN4 基因与 PC 预后相关性采用GEPIA 数据库为TCGA 及CTEx 中 33 种恶性肿瘤的进行数据分析，包括 9 736 例肿瘤组织及8 587 例正常组织的 RNA 测序数据，该数据库为北京大学研发（http：//gepia. cancer‐ pku. cn/）。我们选择肿瘤类型为胰腺癌（n=178），所有数据均进行标准化处理，分析 KCNN4 基因对PC 的预后情况。
4、KCNN4 基因富集分析采用GESA2. 2. 3 软件进行基因富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）分析，以 MSigDB 数据库中 c2. cp. kegg. v5. 2. symbols. gmt 数据集作为功能基因集，根据KCNN4 基因的表达水平分成高表达组和低表达组。按缺省加权富集统计的方法，设置随机组合次数为 1 000 次，分析 KCNN4 基因的表达水平对 PC 患者可能的作用机制。 P<0. 05 及错误发现率FDR（False discovery rates）<0. 05 的基因集作为显著富集基因集。
5、统计学处理采用SPSS 19. 0 统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（-x±s）表示，均数的比较用t 检验，计数资料率的比较采用χ2 检验，以P<0. 05 为差异有统计学意义；生存分析采用 log ‐rank 检验，以P<0. 05 为差异有统计学意义。
二、结果
1、KCNN4基因表达情况GEO 数据库中研究号为GSE15471，包含39 例PC 组织及39 例正常胰腺组织样本，PC 组中KCNN4 表达水平明显高于胰腺组织（t=6. 342，P<0. 001）（图1）。

图 1 KCNN4 基因表达情况
2、KCNN4基因与临床特征的相关性分析纳入研究的162 例PC 患者中，两组比较，KCNN4 基因高表达组与年龄、性别、饮酒、起病部位、淋巴转移、TNM 分期均无明显关系（P>0. 05），与肿瘤分级显著相关（P<0. 05），提示KCNN4 基因高表达的PC患者分级越高，其肿瘤恶性程度更高（表1）。

表 1 162 例PC 患者的临床病理特征与KCNN4 的相关性 [n（%）]
3、KCNN4 基因表达水平与预后的关系利用数居库GEPIA（http：//gepia. cancer‐pku. cn/）分析，选择肿瘤类型为胰腺癌，以 KCNN4 表达值的的中位值分为高低 2 组，KCNN4 高表达组 PC 患者无病生存期明显差于低表达组（log‐rank P=6. 9×10-5）（图 2A）。KCNN4 高表达组PC 患者总生存期明显差于低表达组（log‐rank P=1. 1×10-4）（图 2B）。提示KCNN4 高表达为PC 预后不良因素。
KCNN4 基因表达水平与患者生存期的关系_期刊发表

图 2 KCNN4 基因表达水平与患者生存期的关系
4、 KCNN4 基因高表达组的功能基因集富集GSEA 分析结果提示KCNN4 基因高表达样本主要富集了氨基酰基 tRNA 生物合成、基础转录因子及
嘧啶代谢，提示 KCNN4 可能通过以上生物学过程促进肿瘤细胞增殖，影响患者临床及预后。见表 2 及图 3。

表2 KCNN4 基因GSEA 分析

图 3 KCNN4 基因高表达样本相关富集基因集
三、讨论
PC 是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其高度侵袭性及复发是导致患者预后差的主要原因。PC 的发生、发展是一个多因素、多基因、多信号通路协同作用的过程，但具体的机制仍未完全阐明。目前研究报道，局部微环境对肿瘤的进展有重要作用，离子通道作为肿瘤发生和发展的调节因子，其失调与肿瘤的增殖、侵袭、转移和化疗耐药密切相关［12，13］。K+ 通道在细胞膜的离子通道的多样性最大，在不同类型的K+ 通道中，KCNN4 为中电导性钙离子依赖性钾通道家族成员，位于人第 19 号染色体 q13. 31区域，含 10 个外显子构成，编码的蛋白质含 3 026 个氨基酸，通过释放胞内储存的 Ca2+ 来提供K+ 外流和超极化，调控细胞周期 G0/G1 及 G1/S 期，促进细胞增殖［14］。该基因在许多肿瘤中过表达［5‐7］。目前对KCNN4 在PC 中的研究国内尚未见报道，本研究发现 KCNN4 与 PC 的预后密切相关，提示 KCNN4 可能为PC 的潜在的预后生物标志物。
本研究发现，PC 组中KCNN4 表达水平明显高于胰腺组织（P<0. 05），提示 KCNN4 可能对 PC 的进展具有促进作用。Liu 等报道，KCNN4 在宫颈癌组织中过表达，且在宫颈癌细胞中的上调促进细胞增殖，通过对宫颈癌组织和宫颈癌细胞中细胞生长的作用，表明 KCNN4 是一种新的疾病进展的分子标志物［15］。本研究发现 KCNN4 基因高表达的 PC 患者与肿瘤分级显著相关（P<0. 05），提示分级越高，其肿瘤恶性程度更高。同时本研究进一步分析了KCNN4 对PC 患者预后的影响，结果表明，KCNN4 高表达组PC 患者无病生存期及总生存期均明显差于低表达组（P<0. 05）。本研究结果提示，KCNN4 为PC 预后不良因素，可能作为 PC 预后相关的标志物。Rabjerg 等报道，高 KCNN4 mRNA 表达水平与透明细胞肾癌转移的发生和低生存率有关，对预后有一定的价值［16］。Zhang 等［17］表明，
KCNN4 通道在三阴性乳腺癌中表达，参与三阴性乳腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和 EMT 过程。Chen 等［18］研究表明，肿瘤抑制因子 mir‐497‐5p 下调KCNN4 的表达，抑制血管肉瘤的恶性发展，可能是血管肉瘤治疗的新靶点。这些结果表明KCNN4 基因在肿瘤进展中具有重要作用，与本研究的结果是一致的。调控钾通道已被证明能促进多种癌症的发展和发展，Comes 等研究报道K+ 通道可以确定静息膜电位，从而为胰腺和唾液腺等上皮细胞的离子转运和液体分泌提供动力［19］。因此，我们推测KCNN4 在PC 的进展过程中具有重要作用，本研究表明，KCNN4 与 PC 的预后密切相关，为探讨其生物学过程，进一步行 GSEA 分析，结果提示，KCNN4 基因高表达样本主要富集了氨基酰基tRNA 生物合成、基础转录因子及嘧啶代谢等生物学通路参与PC 的进展。
综上所述，本研究通过生物信息学分析，发现KCNN4 基因在PC 中表达明显增高，且其高表达与肿瘤分级、预后明显相关。其高表达是 PC 的独立危险因素之一，为 PC 提供了一个潜在的治疗靶点，同时也为进一步的研究提供了理论依据。
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